吉林大学:利用CRISPR/Cas9构建转基因猪

    来自吉林大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统高效构建出了myostatin（MSTN）基因突变猪。这一研究成果发布在11月13日的《ScientificReports》杂志上。吉林大学的逄大欣（DaxinPang）教授及焦虎平（HupingJiao）是这篇论文的共同通讯作者。
    开发定制核酸内切酶技术可推动构建出转基因动物，利用它们来探究基因功能及生成人类遗传疾病模型。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9可在特异位点导入DNA双链断裂，然后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组来进行修复。通常，NHEJ修复过程可在双链断裂区域造成小删除或插入基因突变。由于高效且具备快速装配能力，在这三种核酸内切酶技术中CRISPR/Cas9成为一种更强大的工具。当前，研究人员利用CRISPR/Cas9系统已成功构建出了斑马鱼、果蝇、小鼠和猴等许多的转基因动物（延伸阅读：Nature：突破性CRISPR技术生成“安全”转基因作物）。
    Myostatin（MSTN）作为TGF-β超家族的一员，在肌肉生长中发挥负调控因子作用，其为改善家畜生长性能带来了巨大的希望。相比野生型小鼠，MSTN基因敲除（KO）小鼠显示出更结实的肌肉群，一些MSTN自然突变的牛品种也显示更结实的肌肉群。以往的一些研究显示，在进化过程中猪MSTN基因与牛和羊MSTN经历不同的选择压力。有可能MSTN在猪中呈现不同的表达模式或起不同的作用。猪是世界上最重要的家畜之一，猪肉在中国的消费量尤其大。因此，构建出MSTN基因敲除猪对于调查其对肌肉发育和产肉性能的影响意义重大。
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    以往的研究报道称，通过将Cas9mRNA和sgRNA胞质注射到受精卵内，或利用抗生素选择的成纤维细胞进行体细胞核移植（SCNT）来生成基因靶向猪。但这两种方法都有缺点。共同注射Cas9mRNA和sgRNA到受精卵中会生成具有多种表型的嵌合动物，且需要耗费时间和成本完成进一步的猪繁殖工作。来自药物选择成纤维细胞的遗传工程猪往往携带着抗生素耐药基因，它们正日益受到生物安全性关注。
    在这篇新文章中，吉林大学的研究人员报告称他们将猪胚胎成纤维细胞（PFFs）的转染效率提高了接近90%，由此提高了靶向载体的突变效率。他们还证实了CRISPR/Cas9系统可在猪胚胎成纤维细胞MSTN位点诱导NHEJ、长片段删除/倒置及同源指导修复（HDR）。
    最后，研究人员通过体细胞核移植利用无选择标记基因的Cas9/gRNA改造的成纤维细胞生成了基因靶向猪，获得了了MSTN双等位基因突变8只克隆小猪。一些小猪显示明显的肌间沟及大舌头，这是双肌（DM）表型的特征。相比于对照，突变克隆猪的MSTN蛋白水平下降，他们还对MSTN的mRNA水平和相关信号通路因子进行了分析。最后，研究人员仔细评估了克隆猪中的脱靶突变。